Marcaje de la masa del péptido

El marcaje de la masa del péptido (PMF) (también conocido como el marcaje de la proteína) es una técnica analítica para la identificación de la proteína que fue desarrollada en 1993 por varios grupos independientemente. En este método, la proteína desconocida del interés se hiende primero en péptidos más pequeños, cuyas masas absolutas se pueden exactamente medir con un espectrómetro de masas como el MALDI-TOF o ESI-TOF. Estas masas son entonces comparado con una base de datos que contiene secuencias de la proteína conocidas o hasta comparado con el genoma. Esto se consigue usando programas de ordenador que traducen el genoma conocido del organismo en proteínas, entonces teóricamente cortan las proteínas en péptidos y calculan las masas absolutas de los péptidos de cada proteína. Entonces comparan las masas de los péptidos de la proteína desconocida a las masas del péptido teóricas de cada proteína codificada en el genoma. Los resultados según las estadísticas se analizan para encontrar el mejor partido.

La ventaja de este método consiste en que sólo las masas de los péptidos se tienen que conocer. De entretenido novo péptido sequencing es innecesario entonces. Una desventaja es que la secuencia de la proteína tiene que estar presente en la base de datos de interés. Además la mayor parte de algoritmos PMF suponen que los péptidos vengan de una proteína sola. La presencia de una mezcla puede complicar considerablemente el análisis y potencialmente poner en peligro los resultados.

Típico para la identificación de la proteína basada PMF es el requisito para una proteína aislada. Las mezclas que exceden varias 2-3 proteínas típicamente requieren que el uso adicional del MS/MS identificación de la proteína basada consiga la precisión suficiente de la identificación (6). Por lo tanto, las muestras PMF típicas son proteínas aisladas del gel De dos dimensiones electrophoresis (2dos geles) o grupos de la SDS-PÁGINA aislados. Los análisis adicionales por el MS/MS pueden ser o directos, p.ej, el análisis de MALDI-TOF/TOF o el análisis nanoLC-ESI-MS/MS río abajo del gel manchan eluates.

Preparación de la muestra

Las muestras de la proteína se pueden sacar de la SDS-PÁGINA y son sujetas entonces a algunas modificaciones químicas. Los puentes de Disulfide en proteínas se reducen y los aminoácidos cysteine son carboxymethylated por medios químicos o acrylamidated durante el gel electrophoresis.

Entonces las proteínas se cortan en varios fragmentos usando proteolytic enzimas como el trypsin, chymotrypsin o Glu-C. Una proporción sample:protease típica es 50:1. El proteolysis típicamente se realiza durante la noche y los péptidos que resultan se extraen con acetonitrile y se secan bajo el vacío. Los péptidos se disuelven entonces en una pequeña cantidad de agua destilada o adelante se concentran y purificaron la utilización puntas de la Pipeta de ZipTip y están listos para la masa spectrometric el análisis.

Misa spectrometric análisis

La proteína digerida se puede analizar con tipos diferentes de espectrómetros de masas como el ESI-TOF o MALDI-TOF. MALDI-TOF a menudo es el instrumento preferido porque permite un rendimiento de la muestra alto y varias proteínas se pueden analizar en un experimento solo - de ser complementado por el análisis del MS/MS.

Una pequeña fracción del péptido (por lo general 1 microlitro o menos) es pipetted en un objetivo de MALDI y unas sustancias químicas llamaron una matriz se añade a la mezcla del péptido. Las moléculas de la matriz se requieren para el desorption de las moléculas del péptido. La matriz y las moléculas del péptido se co-cristalizan en el MALDI apuntan y están listos para analizarse.

El objetivo se inserta en la cámara del vacío del espectrómetro de masas y el análisis de masas del péptido es iniciado por un rayo láser pulsado que transfiere cantidades altas de la energía en las moléculas de la matriz. La transferencia de la energía es suficiente para promover la transición de moléculas de la matriz y péptidos del estado sólido en el estado de gas. Entonces las moléculas se hacen aceleradas en el campo eléctrico del espectrómetro de masas y vuelan hacia un detector del ión donde su llegada se descubre como una señal eléctrica. Su masa es proporcional a su tiempo de vuelo (TOF) en el tubo de movimiento y se puede calcular en consecuencia.

Análisis computacional

La masa spectrometrical análisis produce una lista de pesos moleculares que a menudo se llama la lista máxima. Las masas del péptido son ahora comparado con bases de datos enormes como Swissprot, Genbank que contienen la información de la secuencia de la proteína. Los programas (ver recursos de web y referencias en Hufnagel, 2006) cortan todas estas proteínas en péptidos con la misma enzima usada en la hendidura química (por ejemplo trypsin). La masa absoluta de todos estos péptidos teóricamente se calcula entonces. Una comparación se hace entre la lista máxima de masas del péptido mesuradas y todas las masas de los péptidos deliberados. Los resultados según las estadísticas se analizan y los partidos posibles se devuelven en una mesa de resultados.

Véase también

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